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關于不同劑量酒精干預腦缺血動物模型的研究進展
有研究表明:飲酒與腦缺血相關。Patra 等分析發(fā)現:與不飲酒的男性相比，每天飲酒 35 g 以下能降低男性缺血性卒中的死亡風險，每天飲酒12g 時死亡風險最低;對于女性，每天飲酒 44 g 以下能降低缺血性腦卒中的死亡風險，死亡風險最低的女性每天飲酒少于12 g;男性每天飲酒少于37 g 或女性每天飲酒少于46 g，缺血性腦卒中的發(fā)病風險下降;每天飲酒12 杯(每杯約含酒精12 g)，缺血性腦卒中的發(fā)病風險最高(以上酒的克數指純酒精含量)。動物模型研究也表明酒精與腦缺血關系密切。由于實際操作中倫理等方面的各種限制，研究酒精對腦缺血的作用不能在人體進行，動物模型便成為研究替代工具。目前酒精干預腦缺血主要使用大鼠、小鼠、沙鼠制作動物模型，研究者根據實驗目的采用不同的酒精給予方式、劑量、給予時間、持續(xù)時間，采用不同的腦缺血方法。本文綜述了以往研究使用過的酒精干預腦缺血模型，并對模型的優(yōu)缺點進行評價。
1 大鼠模型
使用大鼠造模的實驗中，主要應用的是 Wistar和 Sprague-Dawley 雄性大鼠，Wistar 大鼠體重大多在(180 ～320)g，Sprague-Dawley 大鼠體重范圍大多在(230 ～300)g。
1. 1 Wistar 大鼠
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應用 Wistar 大鼠的研究，酒精干預均在腦缺血之前。Favalli 等把 10% v/v 的酒精作為唯一的飲品，持續(xù)給予大鼠28 d。為研究不同時期酒精的作用，分別在給予酒精28d 時或停止給酒精后 24 h用光化學誘導血栓形成的方法造成大腦額頂葉皮質缺血，觀察缺血的額頂葉皮質區(qū)谷氨酸的釋放。采用 Montalbetti等使用過的光化學聯合微透析的方法，發(fā)現飲酒28 d 能輕微減少缺血后谷氨酸的釋放，但并不減輕腦損傷;而停止飲酒 24 h 的大鼠缺血后腦損傷更重，同時谷氨酸和天門冬氨酸釋放增加。用類似方法，研究發(fā)現缺血前 1. 5 h 腹腔注射1. 5、3. 0 g/kg 酒精能顯著減少局灶性腦缺血后谷氨酸的釋放，但不能顯著減輕腦損傷。這種模型適于研究酒精對血小板、血栓形成的影響，而且此模型不需要開顱，動物存活時間長，適于慢性酒精聯合腦缺血研究;此外，皮層梗塞部位可任意選擇，為研究酒精對特定部位皮層缺血的影響提供了條件。但它與人類常見的腦栓塞存在差異，是動脈永久性閉塞，不能觀察酒精對腦血管再通后的影響。吳光、金鮮花等研究長期飲酒大鼠腦缺血后血漿降鈣素基因相關肽 (calcitonin gene relatedpeptide，CGRP)、神經肽 Y( neuropeptide Y，NPY)、內皮素(endothelin，ET)水平的變化。把 95%的醫(yī)用酒精配制成 7.2%的酒精，供大鼠代水自由飲用100 d。線栓法制作局灶性腦缺血模型，缺血前、缺血后1、3、6 h 左心室取血測定血漿 CGRP、NPY、ET，發(fā)現長期飲酒可使腦梗死超早期血漿 CGRP 降低、NPY 和 ET 升高。他們研究長期飲酒大鼠缺血腦組織中 Fas-L 抗原表達[8]時，使用(250 ～320) g 大鼠，造模方法與以上大致相同，不同之處為酒精代水自由飲用時間為 12 周，結果發(fā)現長期飲酒使缺血后Fas-L 陽性表達高峰提前。以上實驗均用酒精代水使動物自由攝入，有可能造成攝入酒精量之間的差別，從而影響實驗結果。
1. 2 Sprague-Dawley 大鼠
1. 2. 1 腦缺血前酒精干預:用未禁食或禁食一夜的大鼠研究酒精對局部腦缺血的急性作用，包括對大腦水腫和腦內鈉、鉀離子含量的影響。用 5% 的葡萄糖配制成20%或30%的酒精，左側大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)前1 h 腹腔注射酒精2 g/kg 或3 g/kg，缺血持續(xù) 4 h 后取腦測定水和離子含量。研究表明 2 g/kg 酒精增加未禁食大鼠腦水腫和腦內鈉離子含量，酒精的這種神經毒性作用可能與升高血糖有關。在禁食一夜的大鼠，腹腔注射酒精聯合腦缺血后沒有出現血糖升高，3 g/kg 劑量的酒精加重大鼠腦水腫，2 g/kg 劑量的酒精不加重腦水腫，且3 g/kg 酒精的神經毒性作用與血糖濃度無關。也有學者使用大鼠全腦缺血模型研究酒精對腦缺血-再灌注損傷后的影響。單邊側腦室注射0、2. 0、8. 0、12. 0、16. 0、18. 0 或 20. 0 mg /kg 的酒精(100%，溶于水，40% v/v)。缺血前20 min 第一次注入酒精，間隔24 h，共注射3 次。使用立體定位注射器以 0.5 L/min 的速度注入酒精，注入 10 min后，以1 mm/min 的速度拔出注射器，縫合切口。缺血15 min 再灌注 3 或 5d。發(fā)現 8.0 -12.0 mg/kg酒精能激活紅藻氨酸 (kainate，KA) 受體中的Gluk1，促 進 依 賴 Ca2 +的 -氨 基 丁 酸 ( gamma-aminobutyric acid，GABA)釋放，激活突觸后 GABAA受體，抑制 c-Jun 氨基端激酶 3 (c-Jun N-terminalkinase 3，JNK3)凋亡通路，發(fā)揮神經保護作用。Zhao 等發(fā)現尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAD(P)H)氧化酶在長期飲酒加重缺血腦損傷中有重要作用。他們使用(200 ～220) g 大鼠，流質酒精飲食(Dyets，Bethlehem，PA)8 周。流食中乙醇含量為6. 4% v/v，食物熱量為1.0 kcal/mL，其中35%來自脂肪，11% 來自碳水化合物，18% 來自蛋白質，36% 來自乙醇;有數據表明，這種飲食時大鼠血液中酒精濃度大約為20 mmol/L。8 周后阻塞大腦中動脈2 h、再灌注 24 h 引起腦損傷。也有學者用同樣的模型研究過長期飲酒對短暫性腦缺血后腦損傷的影響，發(fā)現酒精減弱缺血過程中局部腦血流的反彈性增加。研究長期飲酒對大腦缺血/再灌注損傷影響的劑量依賴性時，Zhao 等同樣使用此模型，1.0 kcal/mL 的流質飲食中含 1、3、5 或 6.4%(v/v)酒精，給予非酒精飲食組、1、3 或 5% (v/v)酒精飲食組的每日飲食量以 6.4% (v/v)酒精飲食為基準[16]，1%酒精減小梗塞體積，6.4% 酒精增大梗塞體積，3%或 5%酒精對梗塞體積無明顯影響。以上模型酒精的干預均在腦缺血之前，模擬了長期飲酒的腦血管病的發(fā)生狀況，可以選擇此類模型研究臨床中不能完成的機制研究。
1. 2. 2 腦缺血之后酒精干預: Wang 等用管腔內線栓阻斷模型研究腦缺血后急性酒精干預的神經保護作用，使用(280 ～300) g 大鼠。為研究不同劑量酒精的作用，把0.5、1.0 或1. 5 g/kg 劑量的酒精用生理鹽水稀釋成 3 mL，于灌注開始時腹腔注射，再灌注48 h 后測定腦梗死體積，發(fā)現:與給予生理鹽水相比，1. 5 g/kg 酒精能把梗塞體積減小47% ，1. 0 g /kg 能減小 23% ，0. 5 g /kg 沒有減小梗塞體積;為探究治療時間窗，于 MCAO 后2、3、4 h 腹腔注射1. 5 g/kg 劑量的酒精，再灌注48 h 后測定腦梗塞體積，發(fā)現 MCAO 后4 h 給予酒精仍能減小梗塞，改善神經功能;為研究酒精與低體溫是否有協同疊加的神經保護作用，MCAO 后90 min 向大鼠全身噴灑酒精將大鼠核心體度降至(32 ～33)℃，MCAO 2 h后停止噴酒精且大鼠自動恢復體溫與此同時腹腔注射1.5 g/kg 酒精，發(fā)現酒精與低體溫沒有疊加的神經保護作用;酒精沒有促進缺血性中風時的腦出血，另外，在缺血性中風時，酒精不增加重組組織型纖 溶 酶 原 激 活 劑 ( recombinant tissue-typeplasminogen activator，rtPA) 或尿激酶 ( urokinase，UK)應用后的腦出血;缺血后 2 h 給予 1. 5 g /kg 酒精，再灌注 3 h 測定低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)，發(fā)現 HIF-1 增加。有研究還表明，常壓氧(normobaric oxygenation，NBO) 聯合酒精對腦缺血有協同神經保護作用，MCAO 2 h 后，于再灌注開始時腹腔注射 1. 0 g /kg酒精(用生理鹽水稀釋成 3ml)，然后給予 2 h 常壓氧(95% O2)，這種保護效應可能與 ADP/ATP 比例、活性氧、NADPH 氧化酶活性降低，丙酮酸脫氫酶活性增強有關。Zeng 等[19]在 MCAO 2 h 后，于灌注開始時腹腔注射1.5 g/kg 酒精，再灌注24 h 測腦水腫、再灌注 48 h 觀察血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的完整性，發(fā)現酒精能減輕腦缺血-再灌注后的腦水腫和 BBB 破壞，可能與酒精減少基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和水通道蛋白(aquaporin，AQP)有關。總之，在制備酒精干預腦缺血模型中，腦缺血 2h MCAO /24 h、48 h 再灌注模型使用較多。Sprague-Dawley 大鼠是制備酒精干預腦缺血模型中最常用的動物。長期飲酒后腦缺血最符合人類發(fā)病順序的模型。2 小鼠(C57BL /6 和 C57BL /6J)模型在小鼠模型的研究中，研究者多使用 2 月齡小鼠，且酒精均在腦缺血之前給予。Wang 等[20]研究酒精預處理(ethanol preconditioning，EtOH-PC)減輕腦缺血-再灌注后白細胞-內皮細胞粘附和遲發(fā)性神經元 死 亡 與 Ca+激 活 的 K+( calcium-activatedpotassium，BKCa)通道激活有關。用[體重(g) 0. 6 + 0. 3]計算 95% 酒精給予量( L)，用無菌蒸餾水把酒精稀釋成0.3 mL，在缺血前24 h 灌胃。因為 EtOH-PC 的早期(1 ～2 h 后)腦保護作用弱于晚期(24 h 后)，所以選擇在酒精預處理后24 h 進行腦缺血-再灌注。夾閉雙側頸總動脈(common carotidarteries，CCA)20 min 造成腦缺血。再灌注 2 h 和 3h 后測定軟膜小靜脈中滾動的白細胞和粘附的白細胞的數量，再灌注4 d 后觀察海馬區(qū)DND、凋亡和膠質細胞激活。Sun 等研究低劑量飲酒可能通過上調過氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR) 減輕小鼠短暫性局灶腦缺血損傷。采用的也是流質1% (v/v) 酒精(Dyets，Bethlehem，PA)飲食8 周，飲食所含能量為1. 0 kcal /mL，其中 35% 來自脂肪，18% 來自蛋白質，42% 來自碳水化合物，5% 來自乙醇。酒精飲食后0. 5、1、2、4 h 血液酒精濃度分別為 0. 8、1. 0、0. 5、0mM。線栓法制備 MCAO，缺血 90 min 再灌注 24 h后觀察腦梗死、DNA 斷裂和核 PPAR 蛋白/活性。目前，使用小鼠(C57BL/6 和 C57BL/6J)研究酒精和腦缺血的關系，優(yōu)勢在于多數轉基因為小鼠(C57BL/6 和 C57BL/6J)，可以用于特定基因功能方面的研究。但缺血性腦卒中在老年人中較為常見，這些實驗使用的小鼠年齡偏小。
3 沙鼠模型
在沙鼠模型的研究中，酒精干預也在腦缺血之前，沙鼠體重大多在(50 ～80) g，且研究者基本采用阻塞雙側 CCA 5 min 制備短暫全腦缺血模型。Xia等將酒精以22.5% (w/v)的濃度混合于奶粉中，用4 g /kg 灌胃 35d。35
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