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蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較
第31卷第4期2008年04月Vol.31No.4Apr.2008第一文庫網(wǎng)
蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較
郭穎娜,孫
(華北制藥股份有限公司,河北
[摘
衛(wèi)
石家莊
050027)
存在和進(jìn)化都密切相關(guān),蛋白質(zhì)含量測(cè)定涉及到生產(chǎn)和科研的眾多領(lǐng)域。目前常用的方法有要]蛋白質(zhì)與生命的起源、
凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)。本文總結(jié)各種方法的特點(diǎn)及適用條件,針對(duì)不同的待測(cè)樣品以及對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的要求不同,我們可以采用不同的方法來測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。
[關(guān)鍵詞]蛋白質(zhì);凱氏定氮法;雙縮脲法;紫外吸收法;考馬斯亮藍(lán)法[中圖分類號(hào)]TS212.7
[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A
[文章編號(hào)]1003-5095(2008)04-0036-02
蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法,是生物化學(xué)研究中最常
用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)。其中Bradford法靈敏度最高,比紫外吸收法靈敏10~20倍,比Biuret法靈敏100倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。這4種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì),每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn),在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮:⑴實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度;⑵蛋白質(zhì)的性質(zhì);⑶溶液中存在的干擾物質(zhì);⑷測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。
1凱氏定氮法1.1原理
凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)過程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化,含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨,氨又與硫酸作用,變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。1.2特點(diǎn)
凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法,是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡單的方法之一,被國際國內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅2.50g,硫酸鉀0.10g,濃硫酸4.00mL;硫酸銅的用量為影響消化時(shí)間的主要因素,硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素;用此最佳條件做實(shí)驗(yàn),消化時(shí)間僅為
[收稿日期]2008-02-13
[作者簡介]
郭穎娜(1979-),女,助理工程師,從事質(zhì)檢工作。
12min;與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對(duì)比,該法所需消化時(shí)間最短,試劑用量減少,可降低實(shí)驗(yàn)成本,也降低了對(duì)環(huán)境的污染。
凱氏定氮法適用范圍廣泛,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí),試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置,可同時(shí)測(cè)定幾份樣品,節(jié)省時(shí)間,提高了工作效率,適用于批量蛋白質(zhì)的測(cè)定,具有準(zhǔn)確、快速、簡便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。2雙縮脲法(Biuret)2.1原理
雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱,放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能夠以1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。2.2特點(diǎn)
雙縮脲法中樣品的取用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響,采用0.5g樣品,40mL雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測(cè)精度。雙縮脲法對(duì)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,不受溫度的影響?煽焖贉y(cè)定蛋白質(zhì)含量,試劑單一,方法簡便,但靈敏度差,測(cè)定范圍為1~20mg蛋白質(zhì)。適用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定,常用于谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定。3紫外吸收法3.1原理
蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性
第4期郭穎娜孫衛(wèi):蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較?37?
質(zhì),吸收峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋
白質(zhì)含量成正比。此外,蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。3.2特點(diǎn)
最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法,含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用280和260nm的吸收差法較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用215與225nm的吸收差法。紫外吸收法簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,低濃度鹽類不干擾測(cè)定,測(cè)定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè),因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其絕對(duì)值。
缺點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)較多,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí),對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差,故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收,但通過校正可以消除。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過校正,測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外,進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。4考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)4.1原理
Bradford法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。考馬斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料,在游離狀態(tài)下呈紅色,在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色,其最大吸收波長從465nm變?yōu)椋担梗担睿恚鞍踪|(zhì)在1~1000μg范圍內(nèi),蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。
4.2特點(diǎn)
考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定,2min左右即達(dá)到平衡,其結(jié)合物室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5~20min之間,顏色的穩(wěn)定性最好。該法方法簡便,易于操作,所用試劑較少,顯色劑易于配制。干擾物質(zhì)少,如糖、緩沖液、還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色。此法的缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用γ-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性,因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測(cè)定微量蛋白質(zhì)的測(cè)定。5結(jié)語
4種蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較如表1所示。
表1
方法
靈敏度
蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較
時(shí)間
原理
說明
量的準(zhǔn)確測(cè)定;干
凱氏定靈敏度低,適用于氮法
0.2~1.0mg
費(fèi)時(shí),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氮,用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含8~10h用酸吸收后滴定。擾少;費(fèi)時(shí)太長。
用于快速測(cè)定,但不太靈敏;不同蛋
2+
8~10hCu→紫色絡(luò)合物。白質(zhì)顯色相似。
雙縮靈敏度低,適用于中速,脲法
1~20mg
多肽鍵+堿性
紫外吸較為靈敏,收法
50~100μg
用于層析柱流出
和色氨酸殘基在液的檢測(cè);核酸的
5~10min280nm處的光吸收。吸收可以校正。最好的方法;干擾物質(zhì)
白質(zhì)結(jié)合時(shí),λmax由少;顏色穩(wěn)定;顏色深淺
5~15min465nm變?yōu)椋担梗担睿。隨蛋白質(zhì)不同而變化。
快速,蛋白質(zhì)中的酪氨酸
考馬斯靈敏度最高,亮籃法1~5μg
快速,考馬斯亮藍(lán)染料與蛋
[參
2006,(2):132-134.
考文獻(xiàn)]
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