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抗性淀粉試劑盒說明書
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抗性淀粉檢測試劑盒
K-RSTAR
（100次分析）
前言
抗性淀粉（RS）是指在人小腸內(nèi)不能被酶解的淀粉，在大腸部分或完全發(fā)酵。RS是總膳食纖維的組分之一。
原理（AOAC法 2002.02 ;AACC法32-40）
抗性淀粉的測定方法： 樣品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振蕩水浴孵育16小時，在這期間，通過兩種酶的聯(lián)合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育結(jié)束后，加入等體積的乙醇或工業(yè)甲基化酒精（IMS,變性乙醇）終止反應(yīng)。離心上述溶液，收集上清勿棄，底部殘留絮狀團(tuán)即為樣品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗滌絮狀團(tuán)，洗滌后離心，再重復(fù)一次洗滌離心，收集離心后獲得的上清，與之前收集的上清混合。小心倒出試管殘留的液體，將絮狀團(tuán)置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同時用磁力攪拌機(jī)劇烈攪拌。用醋酸鹽緩沖液將這個溶液調(diào)至中性，用AMG將淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD）測定，這也是對樣品中RS含量的測定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的測定可通過集中的上清液并定容至100mL，再用GOPOD測定D-葡萄糖完成。
應(yīng)用性和精確性
這個方法需要樣品中RS含量多于2% w/w。如RS含量多于2% w/w，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)誤差為+5%。少于2% w/w RS的誤差更高。
試劑盒
瓶子1：淀粉葡糖苷酶AMG，12 mL，3300U/ mL，條件為pH4.5，40℃下，底物為可溶性淀粉，[單位或為200U/mL，條件為pH4.5，40℃下，底物為對硝基苯基β-麥芽糖苷]。AMG溶液應(yīng)完全沒有可檢測到的游離D-葡萄糖。4℃下穩(wěn)定性> 3年。
瓶子2：α-胰淀粉酶(胰酶，10g，3Ceralpha U/mg)。4℃下穩(wěn)定性> 3年。
瓶子3：GOPOD 試劑緩沖液。磷酸鉀緩沖液（1M，pH7.4），對羥基苯甲酸（0.22M）
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和疊氮化鈉（0.4%W/V）。4
℃下穩(wěn)定性> 3年。
瓶子4：GOPOD試劑酶。葡糖氧化酶（>12,000U）加上過氧化物酶（>650U）和4-氨基安替比林（80mg）。凍干粉，-20℃下穩(wěn)定性>5年。
瓶子5：
D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL,1.0mg/mL）溶于苯甲酸0.2%（w/v）。室溫下穩(wěn)定性>5年。
瓶子6：抗性淀粉對照�？剐缘矸酆咳绫硭�。室溫下穩(wěn)定性>5年。
溶液/懸浮液的制備
1.使用瓶子1中提供的的產(chǎn)品（AMG；溶液1）。這個溶液是有粘性的，因此應(yīng)使用正向4℃下穩(wěn)定性> 3年。
稀釋AMG（300 U/ mL）。取2 mL瓶子1中的AMG濃縮液用0.1M順丁烯二酸鈉緩沖液（0.1M，1，非提供）稀釋至22mL。以5 mL為單位分裝后用聚-20℃>5年。
用前制備
2.用100mL順丁烯二酸鈉緩沖液(100mM，pH6.0；試劑1，非提供)懸浮瓶子2中的產(chǎn)品(α-胰淀粉酶)，攪拌5分鐘。加入1.0mL稀釋的AMG（300 U/ mL），混勻。>1500g離心10分鐘，慢慢倒出上清液，這就是制備的溶液2。溶液2制備后應(yīng)當(dāng)天使用。
3.用蒸餾水稀釋瓶子3中的產(chǎn)品（GOPOD 試劑緩沖液）稀釋至1L，這就是制備的溶液
3。制備后馬上使用。備注：
（1）如果濃縮緩沖液在-20℃下儲存，它將形成結(jié)晶鹽，因此必須要完全溶解才可以用蒸餾水稀釋。
（2）這個緩沖液包含0.4%（w/v）的疊氮化鈉。因此這是個有毒化學(xué)物，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的處理。
4.取瓶3中制備好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的產(chǎn)品，定量轉(zhuǎn)移這個溶液至裝有剩余溶液3的瓶子中。用鋁箔封蓋瓶子以遮光。這就是葡萄糖測定試劑（GOPOD 試劑），可以在2-5℃保存3個月或者-20℃下保存一年。
如果試劑要以冷凍態(tài)儲存，應(yīng)分裝后再凍存。
當(dāng)試劑是新鮮制備的，它的顏色應(yīng)是淺黃色或淺粉色。在4℃儲存2-3個月時會演變成
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深粉色。當(dāng)以蒸餾水為對照時，這個溶液的吸光度應(yīng)小于0.05。
5&6.使用瓶子5或6提供的產(chǎn)品。室溫下穩(wěn)定性>5年。
沒有提供的試劑（應(yīng)購買分析純級）
1.順丁烯二酸鈉（馬來酸鈉）緩沖液(100mM，pH6.0)加上5mM二水氯化鈣和疊氮化鈉（0.02%w/v）.
用1600mL蒸餾水溶解23.2g順丁烯二酸，用4M（160g/L）氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0，加入0.74g二水氯化鈣和0.4g疊氮化鈉，并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。
2.醋酸鈉緩沖液（1.2M，PH3.8）
將69.6mL的冰醋酸（1.05g/mL）加至800 mL的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至pH3.8。用蒸餾水定容至1L，室溫下可保存一年。
3.醋酸鈉緩沖液（100mM，PH4.5）
將5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.5。用蒸餾水定容至1L，4℃保存2個月。
4.氫氧化鉀溶液（2M）
將112.2gKOH加至900 mL的去離子水中，攪拌溶解。定容至1L，密封保存。室溫下可保存2年。
5.含水乙醇（或者IMS）（大約50%v/v）
將500mL乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工業(yè)甲基化酒精（IMS；變性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500mL的水中。密封保存，室溫下穩(wěn)定保存>2年。
備注：
一系列包含RS的對照樣品0.6%-78%w/w可從Megazyme公司購買。
設(shè)備（推薦）
1. 離心式粉碎機(jī)，帶有齒輪轉(zhuǎn)子和1.0mm篩子，或類似的裝置。小型樣品可選擇旋風(fēng)磨碎機(jī)替代。
2.絞肉機(jī)-手動或電動的，裝有4.5mm篩。
3.臺式離心機(jī)-能夠放入16×120mm玻璃試管，速度大約1500g(3000rpm)
4.振蕩水浴器，可設(shè)定為每分鐘100次直線運(yùn)動（振蕩速度為每分鐘200里程），振蕩距離35mm,37℃。
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5.水浴鍋-能夠保持在50+0.1℃。
6.渦旋混勻器。
7.磁力攪拌器。
8.磁力攪拌棒-5×15mm。
9.pH計
10.計時器
11.分析天平（精確到0.1毫克）
12.分光光度計-能夠設(shè)定510nm（10mm路徑長度）
13.100μL移液器及一次性槍頭
14.連續(xù)分配器-配有50mL管嘴，能夠移取2.0mL，3.0mL和4.0mL。
15.培養(yǎng)管-螺旋帽，16×125mm
16.玻璃試管-16×100mm，14mL容量
17.塑料盒，可放置試管架，也可作為冰盒使用。
18.溫度計-能夠讀取37+0.1℃和50+0.1℃。
19.容量瓶-100mL，200mL，500mL，1L，2L
樣品制備
用磨碎機(jī)研磨大約50g谷物樣品或凍干植物或食品，使樣品粉末可過1.0mm篩。轉(zhuǎn)移所有的材料至廣口瓶，顛倒振蕩混勻。工業(yè)淀粉一般不用研磨。用絞肉機(jī)粉碎鮮樣（如罐裝的豆子，香蕉，土豆），過4.5mm篩。用AOAC法925.10（15），測定干樣中的含水量，根據(jù)AOAC法925.10，凍干后烘爐干燥測定鮮樣中的含水量。
分析方法
（a）水解和溶液化非抗性淀粉
1.準(zhǔn)確稱取100mg（±5 mg）樣品后直接倒入有螺旋帽的試管里，輕柔的拍打試管以保證樣品集中在底部。
注意：對于濕樣，樣品大概為0.5g(準(zhǔn)確稱重)，這些材料的含水量通常為60-80%。
2.每個試管中加入4.0 mLα-胰淀粉酶（10 mg/mL）其中含有AMG（3 U/mL）（溶液2）
3.蓋緊試管蓋子，用渦旋振蕩器混勻，臥式放入振蕩水浴器，與運(yùn)動方向平行。
如下圖所示：
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4.連續(xù)振蕩，37℃孵育，精確孵育時間為16小時。（備注：200里程/min）
5.把試管從水浴鍋中拿出，用紙巾擦掉多余的水。拿開蓋子，加入4.0mL乙醇（99% v/v）或者IMS（99% v/v），用渦旋器渦旋。
6.1500g離心，10分鐘（不加蓋）
7.小心倒出上清，加入2mL 50%乙醇或50% IMS重懸浮，用渦旋器渦旋，再加入6mL 50%IMS，混合，1500g離心，10分鐘
8.小心倒出上清，重復(fù)上述重懸浮和離心步驟。
9.小心倒出上清，翻轉(zhuǎn)試管，用紙巾吸除多余的液體。
（b）測定抗性淀粉含量
1.將試管冰浴，再向每個試管中加入磁力攪拌棒和2 mL2M的KOH，用磁力攪拌機(jī)在冰浴/水浴狀態(tài)下攪拌20min，以重懸浮絮狀物和溶解RS。
如下圖所示：
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備注：
（1）不要使用渦旋器混勻，那將會導(dǎo)致淀粉乳化。
（2）確保邊加入KOH溶液邊劇烈攪拌試管里的樣品。這將會避免形成難溶的淀粉塊。
2.向每個試管中加入8 mL1.2M的醋酸鈉緩沖液（pH3.8），并用磁力攪拌機(jī)攪拌。立即加入0.1mLAMG（溶液1；3300U/mL）,混勻，并放入50℃水浴。
3.孵育30min,期間用渦旋器間歇混勻。
4.對于RS含量>10%的樣品，用水洗瓶定量轉(zhuǎn)移試管里的樣品至100mL容量瓶，當(dāng)用洗瓶洗滌試管中的溶液時用外磁鐵保持試管中的磁力棒。用蒸餾水定容至100mL，并混勻。以單位體積離心溶液，1500g，10min。
5.對于RS含量
6.將稀釋的（4.）或非稀釋的（5.）上清液以0.1mL為單位轉(zhuǎn)移至玻璃試管（16×100mm），一式兩份，加入3.0mLGOPOD試劑（溶液4），50℃孵育20分鐘。
7.測量每一個溶液的在510nm下相對于空白試劑的吸光度值。
制備空白試劑
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準(zhǔn)備空白試劑：通過混勻0.1mL的100mM的醋酸鈉緩沖液（pH4.5）和3.0mL的GOPOD試劑
制備D-葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)品（一式四份）通過混合0.1mLD-葡萄糖（1mg/mL）和3.0mL的GOPOD試劑制備D-葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)品。
（c）計算非抗性（可溶性的）淀粉
1.收集起始孵育[(a)7.]過程中離心獲得上清液和兩次50%乙醇洗滌[(a)8.和9.]獲得的上清液至容量瓶中。用100mM的醋酸鈉緩沖液（pH4.5）定容至100mL。混勻。
2.以0.1 mL為單位孵育溶液（一式兩份）并加入10μL稀釋的AMG溶液(300U/mL), 50℃孵育20分鐘,加入3.0 mL GOPOD試劑（溶液4），50℃孵育20分鐘。
3.計算在510nm下相對于空白試劑的吸光度值。
4.計算非抗性淀粉的含量。
計算
計算樣品中抗性淀粉含量，非抗性淀粉含量和總淀粉含量（%，在干重的基礎(chǔ)上），計算模板如下：
抗性淀粉（g/100g樣品）（樣品包含>10%RS）
=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
=⊿E×F/W×90
抗性淀粉（g/100g樣品）（樣品包含
=⊿E×F×10.3/0.1×1/1000×100/W×162/180
=⊿E×F/W×9.27
非抗性淀粉含量（g/100g樣品）
=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
=⊿E×F/W×90
總淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量
⊿E=相對于空白試劑的吸光度值
F=從吸光度值到微克的轉(zhuǎn)換（在GOPOD反應(yīng)中100μgD-葡萄糖的吸光度值是確定的，F(xiàn)=100（D-葡萄糖的μg數(shù)）除以這100μgD-葡萄糖的GOPOD吸光度值）
100/0.1=體積校正（從100mL取0.1mL）
1/1000=從微克到毫克
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W=分析樣本的干重
=重量×（100-含水量）/100
100/ W=RS在樣品重量中百分比因子
162/180=從測定獲得的游離D-葡萄糖轉(zhuǎn)換到淀粉中存在的脫水-D-葡萄糖的因子
10.3/0.1=體積校正（從10.3 mL取0.1mL），對于含有0-10%RS，當(dāng)孵育溶液時沒有被稀釋，最終體積為-10.3 mL。當(dāng)分析濕樣時，體積會增大，在計算時應(yīng)計算折扣。
表1.使用試管內(nèi)分析方法獲得的RS值與活體結(jié)果的比較
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