醛脫氫酶基因敲除的K.pneumoniae重組菌的構(gòu)建

在利用Klebsiella pneumoniae M5aL厭氧發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的過(guò)程中,一部分甘油通過(guò)氧化代謝途徑經(jīng)醛脫氫酶(ALDH)催化合成大量副產(chǎn)物乙醇,降低了1,3-丙二醇的產(chǎn)量和得率.首次以醛脫氫酶ALDH為改造目標(biāo),利用同源重組技術(shù)獲得了ALDH基因敲除的K.pneumoniae重組菌.首先,采用PCR的方法分別從K. pneumoniae M5aL基因組DNA及質(zhì)粒pBR322上擴(kuò)增得到ALDH基因和四環(huán)素抗性基因(Tcr);然后將ALDH基因定向插入到質(zhì)粒pUC18的多克隆位點(diǎn)得到中間載體pUC18-ALDH,該載體與Tcr基因分別用AvaI和BsaAI雙酶切后進(jìn)行連接,得到ALDH基因敲除的重組載體pUCAT;經(jīng)DNA測(cè)序及限制性酶切電泳分析,構(gòu)建的載體由5′ALDH-Tcr-3′ALDH-pUC18組成,與設(shè)計(jì)結(jié)果相符;最后,利用該載體通過(guò)同源重組技術(shù)得到兩株K. pneumoniae重組菌0623-1hb及0623-1hc,經(jīng)菌落PCR及酶活鑒定,兩株菌的ALDH基因均已缺失.與出發(fā)菌株K.pneumonaie M5aL相比,重組菌的乙醇合成濃度降低了43%～53%,1,3-丙二醇合成濃度提高了27%～42%.

作 者： 張延平 劉銘 曹竹安 ZHANG Yan-ping LIU Ming CAO Zhu-an   作者單位： 清華大學(xué)化工系生物化工研究所,北京,100084  刊 名： 中國(guó)生物工程雜志  ISTIC PKU 英文刊名： CHINA BIOTECHNOLOGY  年，卷(期)： 2005 25(12)  分類(lèi)號(hào)： Q81  關(guān)鍵詞： 醛脫氫酶   1,3-丙二醇   乙醇   克氏肺炎桿菌   基因敲除  

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